DNA Sırasındaki Polimeraz Zincir Reaksiyonunda Yer Alan Adımlar

DNA dizisindeki polimeraz zincir reaksiyonunda yer alan ana adımlardan bazıları şunlardır: 1. Adım 1: Isı ile Denatürasyon 2. Adım 2: Hedef Sıraya Tavlama Primer 3. Adım 3: Uzatma 4. Adım 4: İlk PGR Döngüsünün Sonu .

Polimeraz zincir reaksiyonu (PGR), birkaç büyüklük derecesinde tek bir DNA parçasını büyütür, bakınız şekil 6.2. Belirli bir DNA dizisinin binlerce ila milyonlarca kopyasının oluşturulmasıdır.

PGR üç aşamalı bir işlem veya döngüdür. Belirtilen sayıda tekrarlanır. Bir kez PGR döngüsü Denatürasyon, Tavlama ve Uzatma adı verilen bu adımlardan meydana gelir. Bir cihaz, uygun sayıda PGR çevrimi için sıcaklıklar programlanan süre boyunca alternatif olan bir termal döngüleyicide gerçekleşen süreci otomatik olarak kontrol eder.

1. Adım 1: Isı ile Denatürasyon:

Isı normal olarak çift sarmallı DNA'yı iki sarmal halinde ayırırken 90 ° C'nin üstündedir. Bu işlem “denatürasyon” olarak bilinir. Bazları birbirine bağlayan hidrojen bağları zayıftır, bu nedenle denatürasyon mümkündür. Hidrojen bağları yüksek sıcaklıklarda parçalanır, oysa deoksiriboz ve fosfatlar arasındaki bağlar bozulmadan kalır.

2. Adım 2: Hedef Sırayı Tavlama Astarı:

PGR'nin nihai amacı, incelenen organizmaya özgü yaklaşık 100-600 baz çifti hedef dizisini kopyalamaktır. Dizinin hedeflenmesi primerler kullanılarak gerçekleştirilir. Primerler, hedef dizinin uçlarını işaretler.

AMPLICOR® Test primerleri kısa olup, tespit edilmesine yardımcı olmak için 5 ′ uç etiketli bir biotin etiketli tipik 20-30 bazdan oluşan tek sarmallı DNA'nın sentetik dizileridir. Organizmanın hedef bölgesi için, spesifik PGR'lerin, denatürasyon sırasında üretilen tek DNA iplikçiklerinin denatürasyon sırasında üretilen tamamlayıcı tek DNA iplikçiklerinin her biri için iki primer vardır.

İlgili DNA hedef dizisinin başlangıcı, tamamlayıcı diziye tavlanan (bağlanan) primerlerle işaretlenir. Tavlama, primerlerin uzunluğuna ve baz sırasına bağlı olarak genellikle 40 derece santigrat ile 65 derece santigrat arasında gerçekleşir.

3. Adım 3: Uzatma:

Primer tamamlayıcı DNA sekanslarına tavlandıktan sonra sıcaklık yaklaşık 72 santigrat dereceye yükseltilir. Aynı zamanda, Taq DNA polimeraz enzimi, DNA iplikçiklerini çoğaltmak için kullanılır. Taq DNA polimerazı, Thermus aquatics organizmasından gelen rekombinant bir termo kararlı DNA polimerazıdır ve normal polimeraz enzimlerinin aksine, yüksek sıcaklıklarda aktiftir.

Sentez işlemi, çözeltide serbest olan tamamlayıcı nükleotidlerin bağlanmasını ve birleştirilmesini kolaylaştırarak, her ikisi de orijinal çift sarmallı hedef DNA bölgesine özdeş olan yeni çift sarmallı DNA moleküllerini sentezler. Uzatma her zaman astarın 3 ′ ucundan başlar ve her iki teli her birinden bir çift iplik yapar. Taq DNA polimeraz sadece 5 ′ ila 3 ′ yönünde sentezlenir.

4. Adım 4: İlk PGR Döngüsünün Sonu:

İlk PGR döngüsünün sonunda orijinal hedefe özdeş iki yeni DNA zinciri var. Yeni oluşturulan tellerin, primerin 5 by ucu ile kesin olarak tanımlanan bir başlangıcı vardır, ancak 3 ′ ucu kesin olarak tanımlanmamıştır.

Böyle bir şablondan sentezlenen DNA zinciri daha sonra, her iki ucunda iki primerin her birinin 5 by ucu ile sınırlanan kesin olarak tanımlanmış bir uzunluğa sahiptir. Bu DNA iplikçikleri AMPLIGON olarak bilinir. Hedef diziye karşılık gelen DNA iplikçikleri. Sadece birkaç döngüden sonra, değişken uzunluk dizilerinden sonra çok daha büyük sayılar mevcuttur. İki primer tarafından kuşatılmış veya tanımlanmış olan sekans, büyütülmüş kısımdır.