Bitkilerde Agrobacterium Aracılı Gen Transferi | Biyoteknoloji (Diyagramlı)

Bitkilerde Agrobacterium Aracılı Gen Transferi!

Agrobacterium, bitki türlerinde taç safra oluşumuna neden olan gram negatif bir patojenik bakteridir. Taç safra oluşumu, onkogenik (kansere neden olan) bir DNA segmentinin yaralı bölgelerdeki bitki hücresine aktarılmasından kaynaklanmaktadır.

Bu DNA segmenti (transfer DNA veya T-DNA), bakterideki Tümör indükleyici (Ti) plazmidler adı verilen büyük plazmit üzerinde bulunur. T-DNA (yaklaşık 20 kb uzunluğunda) rekombinasyonla bitki kromozomuna entegre edilir. Enfeksiyon sürecini yönlendirmede bir dizi virülans (vir) geni bulunur. Bu yüzden bir bitki kökü veya bir kök yaralandığında kesin bir tepki verir.

Bu sinyallere cevap olarak, A. tumefactions'ın vir genleri aktive olur ve T-DNA'nın Ti plazmidinden bitkinin kromozomuna aktarılması için gereken bir dizi olayı yönlendirir. Farklı vir genlerinin fonksiyonu, bir T-DNA kopyasını içerir, ardından bir ürünün bir lider olarak hareket etmek üzere kopyalanan T-DNA zincirine eklenmesi, ardından bir koruyucu olarak T-DNA'nın uzunluğu ile birlikte proteinler eklenmesi mekanizması.

Bunlar nihayetinde T-DNA'nın geçtiği bakteriyel hücre zarında bir kanal açar. Daha sonra T-DNA, bitkiye yaranın içinden girer. Bununla birlikte, bakteri DNA'sının sitoplazmadan bitki hücresinin çekirdeğine nasıl geçtiği veya T-DNA'nın bitki kromozomlarına nasıl entegre olduğu hala net değildir.

Bu bakterileri bir vektör olarak kullanmak için, sınır bölgeleri ve vir genleri hariç olmak üzere, T-DNA bölgesi çıkarılır. Transgen daha sonra T-DNA bölgeleri arasına sokulur, burada bitki hücresine transfer edilir ve bitkinin kromozomuna entegre edilir (Şekil 1). T-DNA, daha fazla manipülasyonu kolaylaştırmak için boyut olarak kesilmiş ve E. coli'de çoğaltılmış olan Ti-plazmitlerde klonlanır. Bu vektörler Agrobacterium konakçı suşlarına taşınır ve bitki dokularını enfekte etmek için kullanılır.

Bu enfekte olmuş bitki dokuları daha sonra, dönüştürülmüş hücrelerin yenilenmesini kolaylaştırmak için spesifik kimyasallar, büyüme düzenleyicileri içeren ortamlarda büyütülür. Transformantların seçimi, kültür ortamında mevcut olan bir antibiyotik varlığında yapılır. Dönüştürülen bitkiler nihayetinde, eklenen genin kararlı entegrasyonu ve fonksiyonel analizi için analiz edilir.

Protoplast Füzyon:

Hücre çeperi olmayan hücrelere protoplastlar denir. Bu protoplastlar, doğrudan bazı kimyasalların (polietilen glikol, PEG gibi) varlığında DNA'yı alabilir. Daha yüksek PEG konsantrasyonu, DNA'nın protoplastlara alınmasını sağlayan plazma zarının geçirgenleşmesine neden olur. Bir elektrik akımı geçirerek plazma zarında küçük delikler oluşturmak için elektrik sinyalleri bile kullanılabilir.

Bu elektroporasyon olarak bilinir. Bu küçük delikler daha sonra protoplastların yabancı DNA alımına yardımcı olur. Bunu daha sonra hücre duvarı oluşumu ve hücre bölünmesinin başlatılması takip eder. Bununla birlikte, transgenik bitkilerin protoplastlara doğrudan gen aktarımı ile üretilmesi, bitki rejenerasyonuna verimli bir protoplast sistemine bağlıdır.

Gen-gun veya Biolistic Gen Transferi:

Bu, mikro partikülleri (altın veya tungsten gibi) yüksek bir hızda yükleyerek ilgilenilen DNA'yı bir hücreye verebilen en son tekniktir. Bu DNA verme sürecine bombardıman denir. Hücrenin içinde, DNA molekülleri parçacıklardan salınır ve sonunda bu DNA, konak hücrenin nükleer veya organel genomuna entegre edilir.

Eski bitkiler dokuları sonunda dönüştürülmüş bitkileri seçmek için spesifik hormonlar / antibiyotikler içeren ortamda kültürlenir. İlgilenilen gen istenen konakçıya transfer edildikten sonra, bitkilerin yenilenmesi ile yapılan kararlı entegrasyonunun kurulması gerekmektedir. Bu doku kültürü tekniği ile elde edilir.

Doku kültürü süreci genel olarak dört aşamaya ayrılabilir:

Aşama I:

Uygun eksplantların seçimini ve bunun besiyerine aktarılmasını içerir.

Aşama II:

Çarpma ortamı üzerinde büyüyen dokuların çoğalmasını içerir.

Aşama III:

Büyüyen dokuyu (kallus) çeşitli parçalarına ayırt edebildiği ortama aktarmayı içerir.

Aşama IV:

Bitkilerin doğal ortama aktarılmasını içerir. Bununla birlikte, ilgi konusu genler duyu ve antisens oryantasyonu olarak iki şekilde eklenebilir. Geni eksprese etmek veya aşırı eksprese etmek için, gen, sens oryantasyonuna yerleştirilebilir. Bununla birlikte, eğer biri istenmeyen ürünü veya bir biyokimyasal yoldaki bir adımı engellemek istiyorsa, gen antisens oryantasyonuna yerleştirilebilir.