Transgenik Hayvanlar: Farklı Transfeksiyon Yöntemleriyle Gen Transferi Amaçları

Transgenik Hayvanlar: Farklı Transfeksiyon Yöntemleriyle Gen Transferi Amaçları!

Transgenik bir hayvan, genomunda, bir veya başka transfeksiyon tekniği ile eklenen bir gen veya genleri içerir.

Transfeksiyonla ortaya çıkan gen, transgen olarak adlandırılır. Hayvanlarda transfeksiyon, çıplak veya bir vektöre entegre bir DNA segmentinin bir hayvan hücresine dahil edilmesini belirtir.

Gen Aktarımının Amaçları:

1. Hayvanların genetik modifikasyonu süt, et, yün vb. Üretimini arttırmayı amaçlayabilir.

2. Bu tür hayvanların sütünde, idrarında veya kanında bu genler tarafından kodlanan proteinlerin büyük ölçekli bir üretimini elde etmek için genler hayvanlara aktarılmıştır.

3. Özel bir gen transferi vakası, genetik hastalıkların semptomlarını ve bunun sonucunda oluşan sefaletleri hafifletmeyi veya hatta ortadan kaldırmayı amaçlar. Bu yaklaşımda, kusurlu genin normal ve fonksiyonel kopyaları hastaya tanıtılır (gen tedavisi).

4. Özel deneysel ve / veya biyomedikal ihtiyaçları karşılamak için spesifik transgenik hayvan türleri veya soyları oluşturulur.

Transfeksiyon yöntemleri:

DNA'nın, aşağıdaki gibi hayvan hücrelerine / embriyolara verilmesi için çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır:

(i) Kalsiyum fosfat çökeltmesi.

(ii) Doğrudan mikroenjeksiyon.

(iii) Retrovirüs enfeksiyonu.

(iv) Lipofection.

(v) Parçacık silahı teslimatı ve

(vi) Elektropoirasyon.

Kalsiyum Fosfat Yağış:

Bu yaklaşımda, transfeksiyon için kullanılacak DNA preparasyonu ilk önce bir fosfat tamponunda çözülür. Kalsiyum klorür çözeltisi daha sonra DNA çözeltisine eklenir; bu, DNA ile birlikte çöken çözünmeyen kalsiyum fosfat oluşumuna yol açar. Kalsiyum fosfat-DNA çökeltisi transfekte edilecek hücrelere eklenir.

Çökelti parçacıkları, fagositoz ile hücreler tarafından alınır. Başlangıçta, hücrelerin% 1-2'si bu yaklaşımla transfekte edildi. Ancak prosedür şimdi hücrelerin% 20'sine kadar transfeksiyon elde etmek için değiştirildi. Transfekte edilmiş hücrelerin küçük bir kısmında, DNA, stabil veya kalıcı transfeksiyon üreten hücre genomuna entegre olur.

Bu genel yaklaşım hemen hemen tüm memeli hücrelerine uygulanabilir ve çok fazla sayıda hücreye çok az çaba sarf edilerek tedavi edilebilir. Ancak birçok hücre çizgisi kalsiyum fosfatın yüzeylerine veya substratlarına yapışarak çökelmesini sevmez.

lipofeksiyon:

DNA'nın lipozomlar kullanılarak hücrelere verilmesine lipofeksiyon denir. Lipozomlar, uygun bir lipitten hazırlanan küçük veziküllerdir. İlk olarak, noniyonik lipidler, lipozomların hazırlanmasında kullanıldı, böylelikle spesifik kapsülleme prosedürlerinin ardından DNA'nın veziküller içine sokulması gerekiyordu.

Lipozomların yapımı için katyonik lipitlerin kullanılması, DNA'nın kendiliğinden ve verimli bir şekilde kompleksleşmesi ve bu lipozomlarla kapsülleme işlemlerini gereksiz kılan belirgin bir avantajdır. Katyonik lipozomlar, tek bir lipit iki tabakalı membrana (unilamellar) sahiptir ve hücrelere verimli bir şekilde bağlanırlar. Muhtemelen, plazma membranı ile kaynaşırlar ve böylece DNA'yı (onlarla kompleksleşmiş) hücrelere aktarırlar ve bu da transfeksiyonu meydana getirir.

Lipofeksiyon, memeli hücrelerinin in vitro transfeksiyonu için tercih edilen bir yöntemdir. Ayrıca, DNA'yı canlı hayvanlara doğrudan enjeksiyon veya intravenöz enjeksiyon yoluyla vermek için de kullanılmıştır. Katyonik lipozomlar, akciğerlerde marker genlerinin ekspresyonu için farelerde intravenöz veya intratrakeal enjeksiyonda kullanılmıştır. Hedeflenmiş dağıtım ayrıca spesifik ligand proteinlerinin lipozom membranlarına dahil edilmesi ile de gösterilmiştir.

Retroviral Enfeksiyon:

Rekombinant retrovirüsler, hayvan hücrelerini ve farelerin embriyolarını enfekte etmek için kullanılan viryonları üretir. Rekombinant retrovirüs RNA genomu, hücrenin genomuna entegre olan bir DNA kopyası (gelir transkripsiyonu) verecek şekilde ters transkriptaz ile kopyalanır. Ters transkriptaz, retrovirüs tarafından kodlanır ve enfeksiyondan hemen sonra üretilir.

Bununla birlikte, ters transkripsiyon sadece S fazından geçen, yani mitotik olarak aktif olan hücrelerde oluşabilir. Rekombinant retrovirüsün DNA kopyası, rastgele bölgelerdeki hücresel genomla birleşir ve genellikle silmelere veya yeniden düzenlemelere eşlik etmez.

Mikroenjeksiyon:

Bu yöntemde, DNA çözeltisi doğrudan bir hücrenin çekirdeğine veya döllenmiş bir ila iki hücreli ovumun erkek pronükleusuna enjekte edilir. Tipik olarak, bir mikroenjeksiyon tertibatı, düşük güçlü bir stereoskopik diseksiyon mikroskobu (ovumu ve tüm süreci görüntülemek için) ve biri bir mikro mikropipet için, bir tane ovumu kısmi emme ile tutmak için, diğeri de cam enjeksiyon iğnesinin sokulması için bir cam mikropipetten oluşur. Erkek pronükleusa DNA. Erkek pronükleus, döllenmiş memeli ovalarının dişi pronükleusundan çok daha büyüktür. Bununla birlikte, balık yumurtasındaki DNA, yumurta sitoplazmasına enjekte edilir.

Mikroenjeksiyon için genel prosedür aşağıdaki gibidir: Donör dişiler, uygun hormon tedavileri kullanılarak süper yumurtlamaya teşvik edilir. Superovüle edilmiş dişiler daha sonra fertil erkeklerle çiftleştirilir ve çok sayıda döllenmiş bir veya iki hücreli yumurtalık / embriyo cerrahi olarak toplanır. Alternatif olarak, döllenmemiş ovalar süper yumurtlanmış dişilerden toplanır; ova daha sonra in vitro döllenir. Transgen yapısı bir tampon çözeltide hazırlanır ve bir mikroenjeksiyon tertibatı kullanılarak döllenmiş yumurtaların erkek eşyalarına enjekte edilir.